Genetyka jako nauka.
Wraz z rozwojem nauk biologicznych powstala nauka badajaca zjawiska dziedzicznosci i zmiennosci, ktora okreslono mianem genetyki (od grec. genetes = zrodzony). Podstawowe prawa dziedziczenia odkryte zostaly za sprawa Grzegorza Mendla – przeora klasztoru augustynianow w Brnie na Morawach. Praca Mendla zostala opublikowana 1865 roku, lecz przeszla calkowicie bez echa. Dopiero w 1900 roku, dzieki trzem uczonym H. de Vriesa, C. Corrensa i E. Tschermaka, dzielo Mendla stalo sie podstawa wspolczesnej genetyki. Natomiast odkrycie struktury DNA w 1953 (J.D. Watson i F. Crick) stworzylo podwaliny dla nowego kierunku w genetyce – genetyki molekularnej.
Umiejetnosc manipulowania genami stala sie jednym z najwazniejszych osiagniec naukowych XX wieku. Na przestrzeni ostatniego stulecia genetyka wkroczyla w praktycznie kazda dziedzine biologii, aby stac sie jej nieodzwnym narzedziem. Nowe zastosowania technik inzynierii genetycznej beda mialy w przyszlosci olbzymie znaczenie, zwlaszcza w medycynie i rolnictwie.
Wspolczesna genetyke mozna podzielic na dwa kierunki:
• genetyke klasyczna, wykorzystujaca glownie osiagniecia Mendla,
• genetyke molekularna, badajaca zagadnienie dziedziczenia na poziomie molekularnym
Elementy inzynierii genetycznej i biotechnologii
W ostatnich latach stworzono wiele nowych metod zwiazanych z modyfikacja DNA in vitro. I wlasnie dzialania, ktore maja na celu rekombinacje kwasow nukleninowych (w sztucznych warunkach) pochodzacych z roznych zrodel, a nastepnie wprowadzanie ich do odpowiednio przygotowanych zywych komorek, w celu uzyskania replikacji lub ekspresji zawartych tam genow, nazwano inzynieria genetyczna.
Rozwoj technik inzynierii genetycznej pozwolil na ich technologiczne wykorzystanie. Zintegrowanie zastosowan wiedzy i technik z zakresu biologii molekularnej, biochemii, mikrobiologii oraz nauk inzynieryjnych w celu technologicznego wykorzystania drobnoustrojow, kultur tkankowych lub elementow komorek (np.enzymow) doprowadzilo do powstania biotechnologii. Obecnie wytwarzane sa tzw. uzyteczne organizmy oraz substancje pochodzace z organizmow dzieki mozliwosci kontrolowanej modyfikacji genotypow i tworzeniu nowych kombinacji genowych.
Wlasnie techniki inzynierii genetycznej sa najbardziej perspektywiczne jezeli chodzi o zastosowanie biotechnologiczne. Bez nich niemozliwe byloby szereg osiagniec biotechnologii w medycenie, przemysle farmaceutycznym, czy hodowlii. Jednakze mimo niebagatelnego wkladu jaki biotechnologia wniosla w zycie codzienne, caly czas budzi ona sprzeciwy, obawy i emocje. Nadal uznaje sie trudne do przewidzenia wprowadzenie organizmow ze zrekombinowanymi kwasami nukleinowymi do srodowiska naturalnego. Nadal, glownie w srodowiskach pozanaukowych, biotechnologia spotyka sie ze sporymi sprzeciwami. Prowadzone sa jednak intensywne badania bezpieczenstwa pracy w przemysle stosujacym zrekombinowane organizmy.
Inzynieria genetyczna
Techniki inzynierii genetycznej polegaja na wprowadzeniu do komorki obcego genu w taki sposob, aby zachowywal on swoje naturalne wlasciwosci (ulegal replikacji lub ekspresji). Bardzo istotna przeszkoda zwiazana z technikami inzynierii genetycznej jest fakt, ze ewentualnych wynikow pracy nie mozna zaobserwowac makroskopowo. Nie jestesmy w stanie zaobserwowac jak dziala gen (np. pod mikroskopem). Jedyna rzecza mozliwa do zaobserwowania jest efekt tej dzialalnosci, czyli fenotyp badanego organizmu. Zatem wiekszosc technk inzynierii genetycznej opiera sie na analizie skutkow dzialania odpowiednio zmienionych genow. Przez to praca genetyka polega glownie na obserwacji roznokolorowych kolonii, analizie zeli elektroforetycznych, czy odpowiednio naswietlonych klisz fotograficznych.
Kolejne punkty przybliza mozliwosci jakie stwarza ta nowa dzedzina wiedzy.
• Narzedzia stosowane w inzynierii genetycznej,
• Organizmy modelowe w inzynierii genetycznej,
• Klonowanie, czyli wprowadzanie zrekombinowanego DNA do komorek, w celu namnozenia lub wizolowania pozadanych genow,
• Ekspresja wprowadzanego genu,
Narzedzia stosowane w inzynierii genetycznej
Enzymy restrykcyjne (restryktazy).
Sa to enzymy nalezace do grupy endonukleaz (czyli enzymow zdolnych do rozcinania DNA w miejscu polozonym w srodku nici). Znane jest kilka klas restryktaz, lecz najwieksze znaczenie maja enzymu II klasy, zdolne do przecinania DNA w obrebie scisle okreslonej sekwencji (skladajacej sie z 4-8 nukleotydow) lub stalej odleglosci od danej sekwencji. Naturalnie restyktazy wystepuja u bakterii i sinic, stanowiac element tzw. systemu \”restrykcji-modyfikacji\”. System ten zaklada istnienie w komorce mikroorganizmow dwoch rodzajow enzymow, z ktorych jeden jest enzymem restrykcyjnym (patrz. wyzej), zas drugi jest bialkiem zdolnym do modyfikacji DNA (np. metylowania) sekwencji rozpoznawanych przez restryktaze. Modyfikacja taka chroni DNA przed atakiem wlasnych enzymow restrykcyjnych. System ten chroni komorke przed wnikaniem obcego DNA (np. DNA bakteriofagow). Obce – niezmodyfikowane – DNA jest zaraz po wniknieciu degradowane przez endogenne restrykazy.
Sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne sa zwykle palindromami – sa jednakowe czytane do konca 3\’ do 5\’, jak i od 5\’ do 3\’. Enzymy restrykcyjne sa glownym narzedziem inzynierii genetycznej. Znajac sekwencje nukleotydowa DNA i majac do dyspozycji kilka tysiecy restryktaz (tyle wlasnie ich poznano) mozemy wyciac w zasadzie dowolny fragment.
Inne enzymy, bedace narzedziami inzynierii genetycznej
Obok restryktaz istnieje szereg innych enzymow wykorzystywanych w inzynierii genetycznej, naleze do nich:
• Ligazy, pozwalajace na laczenie fragmentow DNA,
• Egzonukleazy, umozliwiajace odpowiednia \”obrobke\” koncow w modyfikowanych fragmentach DNA,
• Polimerazy, ktore odpowiedzialne sa za powielanie (amplifikacje) odpwiednich odcinkow DNA (porownaj Reakcja lancuchowa polimerazy – PCR).
Wektory.
Chcac wprowadzic fragment obcego DNA do komorki biorcy, w celu uzyskania replikacji i/lub ekspresji, jednoczesnie unikajac jego degradacjii nalezy sie posluzyc wektorem (lac. vector – przewoznik). Wektory sa czastkami DNA, majacymi zdolnosc do autonomicznej replikacji w danym typie komorek, zapewniajac tym samym powielenie wprowadzonego fragmentu, a czesto rowniez ekspresje zawartej w nim informacji genetycznej (wektory ekspresyjne).
Aby czastka DNA mogla byc wektorem musi miec nastrepujece elementy:
• Sekwencje odpowedzialne za inicjacje replikacji tzw. ori (ang. origin of replication),
• Jedno (tylko jedno) miejsce rozpoznawane i ciete przez enzym restrykcyjny,
• Geny markerowe pozwalajace na selekcje komorek stransformowanych (tych, ktore przyjely wektor) i zrekombinowanych (czyli tych, ktore przyjely wektor ze \”wstawka\”).
Dodatkowo w przypadku wektorow ekspresyjnych:
• Promotor umozliwiajacy ekspresje wprowadzonych genow,
• Miejsce ciecia enzymu musi byc zgodne z otwarta ramka odczytu.
Niestety nie ma uniwersalnych wektorow dla wszystkich rodzajow komorek. Roznice w przebiegu poszczegolnych etapow ekspresji genow u roznych gatunkow, rodza potrzebe stosowania roznych wektorow, w zaleznosci od biorcy. Do najczesciej stosowanych wektorow naleza:
• Wektory plazmidowe.
Naturalnie wystepujace w komorkach bakterii koliste czastki DNA, zdolne do samodzielnej replikacji – plazmidy, zostaly wykorzystane do przenoszenia czasteczek obcego DNA wlasnie do komorek bakteryjnych. Dodatkowo wektory plazmidowe sa wyposazone w odpowiednie geny markerowe (nadajace opornosc na antybiotyki lub odpowiednie zabarwienie kolonii) pozwalajace na latwa selekcje klonow.
• Wektory – pochodne bakteriofagow.
Do najczesciej stosowanych, wsrod tej klasy, naleza wektory, bedace pochodnymi faga lambda. Wektory te maja pewna przewage nad wektorami plazmidowymi. Infekcja czastkami bakteriofagow jest duzo bardziej wydajna od transformacji bakteryjnej. Jednoczesnie, moga one pomiescic duzo wiecej DNA do klonowania.
• Inne wektory.
Obok bakterii, bardzo waznymi organizmami modelowymi w inzynierii genetycznej sa drozdze (glownie gatunek Saccharomyces cerevisiae). Do klonowania genow w tych organizmach stosuje sie czasteczki DNA z sekwencjami odpowiedzialnymi za replikacje (tzw. ars) oraz naturalne plazmidy drozdzowe (2 ). W wektorach ekspresyjnych dodatkowo wystepuja silne promotory (np. z genu GALI, kodujacego galaktokinaze). Czasto wektory drozdzowe konstruowane sa jako wektory bifunkcjonalne (wahadlowe). Tego typu wektory sa zdolne do replikacji zarowno w komorkach bakteryjnych (E. coli), jak i w drozdzach.
Wprowadzanie obcego DNA do komorek wyzszych Eucariota jest duzo bardziej skomplikowane w porownaniu z organizmami nizszymi. Naukowcy nie dysponuja tak doskonalymi wekorami jak w przypadku bakterii czy drozdzy. NIe minej jednak opanowano trudna sztuke transformacji roslin i zwerzat.
• W przypadku roslin stosuje sie pochodne wirusow (przykladowo wirus mozaiki tytoniowej) lub plazmidow, ktore pochodza z bakterii majacych zdolnosc do zakazania roslin (np. plazmid Ti z Agrobacterium tumefaciens.
• Do komorek zwierzecych DNA wprowadza sie za pomoca wektorow pochodzenia wirusowego (np. SV40, papilioma, wirusa krowienki, adenowirusow i retrowirusow)
Organizmy wykorzystywane w inzynierii genetycznej
Obcy fragment DNA, polaczny z wektorem nalezy wprowadzic do komorki, w ktorej ulegnie on powieleniu. Do tego celu, w zaleznosci od charakteru doswiadczenia, wykorzystuje sie komorki roznych organizmow.
• Bakterie.
Bakterie wykorzystywane w inzynierii genetycznej to gownie specjalnie zmodyfikowane szczepy gatunku Escherichia coli, aczkolwiek znane sa rowniez zastosowania bakterii z rodzajow Bacillus i Haemophilus. Zaleta tych organizmow jest latwosc pobierania czasteczek DNA – transformacji, choc czasami (jak w przypadku E. coli), konieczne jest poddawanie ich pewnym zabiegom (tzw. wprowadzanie w stan kompetencji). Innymi zaletami sa posiadanie plazmidow (patrz wektory plazmidowe) oraz fakt, ze komorki te moga byc infekowane przez bakteriofagi, co umozliwia wykorzystanie bakteriofagow jako wektorow (patrz wektory, bedace pochodnymi fagow bakteryjnych). Dodatkowa cecha decydujaca o wykorzystywaniu tych oganizmow przy doswiadczeniach inzynierii genetycznej jest latwosc hodowli. Bakterie zdolne sa do wzrostu na dosc prostych pozywkach, a zdolnosc do tworzenia kolonii, bedacych pochodnymi jednej komorki ulatwia analize fenotypowa (rozroznienie po wielkosci kolorze i ksztalcie kolonii).
• Drozdze
Drozdze sa mikroorganizmami, zatem wykazuja podobne do bakterii wlasciwosci w zakresie hodowli i transformacji. Nie nalezy jednak zapominaco tym, ze sa to organizmy eukariotyczne. Stwarza to dodatkowe mozliwosci, przy kolonowaniu genow, pochodzacych od innych Eucariota. Dodatkowo w dzozdzowym cyklu zyciowym wystepuje faza haploidalna i diploidalna, co przyczynilo sie do dobrego scharakteryzowania tych organizmow od strony genetyki klasycznej.
Klonowanie
Klonowanie, czyli wprowadzanie zrekombinowanego DNA do komorek, w celu namnozenia lub wizolowania pozadanych genow.
Ogolny schemat procesu klonowania genu moze przebiegac nastepujaco:
• Fragmentacja DNA, w ktorym chcemy odnalesc lub namnozyc pozadany gen. Do tego celu stosuje sie enzymy restrykcyjne.
• Polaczenie pofragmentowanego DNA z odpowiednim wektorem – tzw. ligacja, przeprowadzana przez odpowiednie enzymy – ligazy,
• Wprowadzenie zrekombinowanego DNA do komorek mikroorganizmow – transformacja. Komorki pobiora rozne fragmenty DNA, kazda z nich bedzie pojedynczym klonem. W ten sposob otrzymujemy tzw. bank genow.
• Identyfikacja zrekombinowanych genow w poszczegolnych klonach. Jest to najtrudniejszy etap przy klonowaniu genow.
Ekspresja wprowadzanego genu
Czesto przy eksperymentach inzynierii genetycznej wprowadzanie obcego DNA do komorek biorcy ma na celu ekspresje zawartej w genach informacji o budowie bialek. Do tego celu stosuje wektory ekspresyjne . Przewaznie ekspresji zrekombinowanych genow dokonuje sie w bakteriach, czyli organizmach prokariotycznych. O ile geny Procariota daja sie latwo klonowac i pozniej ulegac ekspresji, to przy probach ekspresji informacji zawartej w genach eukariotycznych pojawiaja sie pewne problemy. Po pierwsze Eucariota maja nieco odmienny mechanizm ekspresji, po drugie bakteryjna maszyneria genowa nie jest zdolna do pokanania przeszkody jaka sa introny. Problemy te mozna jednak ominac stosujac zabieg polegajacy na przepisaniu informacji z bezintronowego mRNA (po owczesnym wizolowaniu) na DNA. Proces ten moze byc zrealizowany przez specjalny enzym – polimeraze DNA zalezna od RNA (tzw. odwrotna transkryptaze). Enzym ten zostal wykryty przez Baltimor\’a u pewnych wirusow, ktorych informacja genetyczna wystepuje w postaci RNA (tzw. retrowirusy; tu jedna uwaga, nie wszystkie RNA-wirusy sa retrowirusami). DNA powstale z przepisania mRNA zwane jest cDNA. Wlasnie cDNA moze ulegac ekspresji po wprowadzeniu do komorek bakteryjnych na odpowiednim wektorze.
Biotechnologia.
Rozwoj technik rekombinowania i klonowania DNA, nauk biologicznych (biochemia, mikrobiologia) i inzynieryjnych pozwolil na wprowadzenie w zycie codzienne szeregu inowacji. Zmian tych dokonano w zakresie:
• medycyny (lecznictwo, farmaceutyka, diagnostyka i profilaktyka),
• hodowli roslin i zwierzat (organizmy transgeniczne).
Jednakze mimo szybkiego rozwoju tej dziedziny, istnieje nadal ogromna liczba problemow, na ktorych rozwiazanie trzeba bedzie jeszcze dlugo poczekac. Naleza do nich m.in.:
• Udoskonalenie technik somatycznej terapii genowej,
• Wytwarzanie lepszych lekow bialkowych i peptydowych,
• Produkcja nowych i udoskonalenie starch szczepionek przeciw chorobom zakaznym,
Zastosowanie biotechnologii w medycynie.
W ostatnich latach zastosowanie metod rekombinacji DNA w lecznictwie i farmaceutyce doprowadzilo do znacznego postepu w zwalczaniu chorob i produkcji lekow. Znane i powszechnie uzywane sa leki stworzone przy uzyciu technik rekombinacji DNA (np. ludzka insulina – Humulina, czy erytropoetyna – Epogen). Niemniej jednak wiele istotnych zagadnien pozostaje w dalszym ciagu niewiadoma lub wymaga udoskonalenia.
Ponizej przedstawiono niektore kierunki rozwoju biotechnologii medycznej. Ze wzgledu na bardzo szeroki zakres projektow w tej dziedzinie, ograniczono sie jedynie do przytczenia najistotniejszych przykladow.
Szczepionki.
Ciekawym osiagnieciem w tej dziedzinie bylo zinzynierowanie preparatu szczepionki przeciw wirusowi HBV, powodujacemu zapalenie watroby typu B (HBV od ang: Hepatitis B Virus). Sklonowano sekwencje nukleotydowa, ktora koduje bialko kapsydu (glikoproteine HBsAg) na ekspresyjnym wektorze bifunkcjonalnym (zdolnym do funkcjonowania w komorkach bakterii Escherichia coli i w drozdzach Saccharomyces cerevisiae). Uzyskano dobry poziom ekspresji, z jednoczesna aktywnoscia immunologiczna produktu. Dodatkowo podniesiono poziom ekspresji tego bialka po dolaczeniu genu do sekwencji regulatorowych silnie eksprymowanego genu drodzdzowego (dehydrogenazy aldehydu 3-P-glicerynowego). Preparat poddano probom klinicznym. Okazalo sie, ze pacjeci wszystkich grup tolerowali ja dobrze i wytwarzali przeciwciala przeciw bialku kapsydu.
Nowe leki
Po skolonowaniu kilkunastu genow ludzkich w ostatnich latach, przystapiono do opracowywania technologii efektywnej ekspresji produktow tych genow.
• Po ekspresji cytokin (modulatorow ukladu immunologicznego) przeprowadzono szereg doswiadczen dotyczacych ich dzialania na organizmy zwierzece. Niestety niedostateczna wiedza w zakresie mechanizmow molekularnych i fizjologicznych nie pozwolila na pelne wykorzystanie ich wlasciwosci terapeutycznych.
• Duzy wysilek wlozono w otrzymywanie lekow przeciwko chorobom ukladu krazenia, w szczegolnosci lekow rozpuszczajacych zakrzepy krwi.
• Probowano ekspresji heterologicznej (tzn. w organizmach obcych w stosunku do wyrazanego genu) ludzkiej albuminy osocza (stosowana przy oparzeniach, pomocna w opanowaniu rozleglych krwotokow) i hemoglobiny (pomocna w roznego rodzaju zabiegach hirurgicznych). Wykazano,ze albumina moze byc produkowana w przemyslowych szczepach drozdzy (obecnie albumina jest uzyskiwana od dawcow krwi i z lozysk plodowych). Hemoglobina natomiast moze byc syntetyzowana dzieki zastosowaniu transgenicznych organizmow (np. swin).
Somatyczna terapia genowa.
W przypadku genetycznych chorob jednogenowych mozna probowac terapii polegajacej na wprowadzeniu prawidlowych kopii genow do zmutowanych komorek somatycznych. Takie proby poprzedzic nalezy nastepujacymi etapami:
• klonowanie prawidlowej wersji genu,
• identyfikacja sekwencji regulatorowych,
• identyfikacja komorek, w ktorych dziala badany gen,
• wybor efektywnej matody transinfekcji.
Z zasadniczymi trudnosciami laczy sie ostatni z wymienionych etapow. Do tej pory nieznaleziono niezawodnego, powtarzalnego i wydajnego sposobu transfekcji komorek eukariotycznych. Obecnie najwieksze nadzieje wiaze sie z zastosowanien wektorow, ktore sa pochodnymi retrowirusow i adenowirusow. Probowano takze wprowadzic DNA przy pomocy innych wirusow (glownie RNA), jak rowniez liposomow.
Do tej pory przeprowadzono kilka kuracji z zastosowaniem terapii genowej. Jednym z najbardziej znanych przykladow jest proba leczenia kilku pacientow chorych na zlozony zespol niedoboru odpornosci, zwiazany z brakiem deaminazy adenozyny (ADA). Do krwioobiegu wprowadzono limfocyty transfekowane wektorem retrowirusowym z prawidlowa wersja genu ADA. Terapia poskutkowala, zaobserwowano odpornosc na antygeny i pojawienie sie przeciwcial. Ze wzgledu na zywotnosc limfocytow taki zabieg musial zostac powtorzony wielokrotnie.
Zastosowanie biotechnologii w hodowli roslin i zwierzat.
Zastosowanie biotechnologii w hodowli roslin zwierzat w znacznej mierze polega na tworzeniu organizmow transgenicznych, czyli takich, ktorym wprowadzono nowy, heterologiczny gen, przekazywany nastepnym pokoleniom zgodnie z prawami genetyki.
Biotechnologiczne zmienianie roslin
Rosliny sa doskonalymi organizmami pod wzgledem zastosowan biotechnologicznych. W odroznieniu od zwierzat maja zdolnosc do odtworzenia calego organizmu z pojedynczej komorki somatycznej, co daje znakomite mozliwosci transgenizacji.
Każdy człowiek ma swój indywidualny układ informacji genetycznej. Od genów w dużym stopniu zależy nasze życie; to, jak wyglądamy, na co chorujemy.
Nieśmiertelność w zasięgu ręki?
Znajomość genów danego człowieka sprawi, że lekarze będą mogli wcześnie określać skłonności danego człowieka do chorób i wcześniej im zapobiegać. Przykładowo: robiąc test genetyczny 15-latka można będzie stwierdzić, na jakie choroby jest on szczególnie podatny. Wiedząc, że może on w przyszłości zachorować np. na cukrzycę będzie on mógł stosować odpowiednią dietę.
W przyszłości wiedza o genomie posłuży do opracowywania skutecznych terapii genetycznych. Lekarze będą w stanie przewidzieć, komu pomoże konkretny lek i w jakiej dawce. W przypadku wykrycia w organizmie wadliwego genu byłaby możliwość jego \”naprawy\” albo wręcz wymienić geny chore na zdrowe. Metoda ta umożliwi projektowanie leków na nieuleczalne dotąd choroby, takie jak AIDS czy rak. Niektórzy naukowcy sądzę, że będzie to pierwszy krok do uzyskania nieśmiertelności przez człowieka…
Niebezpieczna wiedza
Badania nad genomem ludzkim wzbudzają również obawy. Chodzi o możliwość stworzenia broni biologicznej, która może zagrażać życiu określonych grup ludzi. Innym problemem będą skutki dostępności informacji o naszym kodzie genetycznym. Pracodawca, zlecając zbadanie naszego włosa, będzie mógł się dowiedzieć o naszym organizmie praktycznie wszystkiego. Będzie wiedział, czy mamy skłonność do nałogów czy jesteśmy podatni na przeziębienia. Wiedza tego typu spowoduje podwyższenie… stawek w towarzystwach ubezpieczeniowych Jawność takich informacji może wielu osobom zrujnować życie.
Na skutki poznania ludzkiego DNA będziemy musieli czekać długo. Prawdopodobnie jednak za kilkadziesiąt lat genetyka zupełnie zmieni nasze życie.
