ENZYMY , KTÓRE TNĄ DNA NA FRAGMENTY I ŁĄCZĄ JE POZWALAJĄC NA NIEZLICZONĄ ILOŚĆ KOMBINACJI TYCHŻE.
RESTRYKTAZY – tną DNA tworząc powtarzalny komplet fragmentów.
Restryktazy (inaczej enzymy restrykcyjne , endonukleazy restrykcyjne) – to enzymy izolowane z bakterii , zdolne do rozpoznawania specyficznych sekwencji w DNA (z reguły są to sekwencje palindromowe) i do przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA w ściśle określonym miejscu , w obrębie lub okolicy sekwencji rozpoznawanej. Otrzymywane fragmenty DNA nie są losowe a w każdym prążku na żelu znajdują się cząsteczki DNA o identycznej sekwencji nukleotydowej. Z reguły różne enzymy rozpoznają odmienne sekwencje DNA. Istnieją jednak wyjątki – tzw. izoschizomery – enzymy izolowane z różnych organizmów ale rozpoznające te same sekwencje. Zdarza się także , że dwa enzymy wytwarzają takie same lepkie końce , mimo rozpoznawania różnych sekwencji DNA. Umożliwia to klonowanie DNA strawionego jednym enzymem w wektorze strawionym innym , dającym takie same lepkie końce.
Nazewnictwo opiera się na literowych skrótach , w których pierwsza litera pochodzi od rodzaju bakterii , a druga i trzecia od gatunku. Następna litera oznacza szczep lub lub typ a kolejne enzymy z danego szczepu lub typu otrzymują litery rzymskie.
Jednostka enzymu restrykcyjnego to taka jego ilość , która trawi kompletnie 1mg DNA faga l (około 50 kb) w czasie 1 godz. w temperaturze 37°C.
Podział restryktaz według rodzaju wytwarzanych końców :
– tępe końce – nici rozcięte naprzeciwko siebie – wszystkie nukleotydy są sparowane z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnym łańcuchu
– lepkie końce – 3` lub 5` ssDNA (jednoniciowe) ogony na obu końcach utworzone przez niesymetryczne cięcie , komplementarne do podobnych tworzonych w innych cząsteczkach DNA przez te same enzymy restrykcyjne niezależnie od źródła DNA , co pozwala na ligowanie DNA nawet bardzo różniących się gatunków czyli formowanie chimerycznych molekuł.
Modyfikacje końców :
– tępych , poprzez dołączenie adaptorów (krótkich fragmentów DNA zakończonych z jednej strony na tępo z drugiej na lepko , specyficznie dla danej restryktazy) lub linkerów (krótkich fragmentów DNA zawierających określone miejsce restrykcyjne , zakończonych na tępo) , przed dołączeniem tych ostatnich należy zmetylować genomowy DNA odpowiednią metylazą a po ligacji strawić DNA daną restryktazą uzyskując lepkie końce
– lepkich , które mają cofniętą nić 3` Można je wypełnić przy pomocy fragmentu Klenowa polimerazy DNA E.coli i kompletu nukleotydów.
– lepkich , które mają cofniętą nić 5` Można je wytępić obcinając wysunięty jednoniciowy odcinek DNA przy użyciu nukleazy S1 lub polimerazy I E.coli wykorzystując jej aktywność egzonukleolityczną 3`(R)5`.
Podział restryktaz według sekwencji rozpoznawanej :
– czwórkowe , rozpoznają sekwencję DNA złożoną z czterech nukleotydów. Statystycznie w dowolnym DNA takich miejsc jest dużo – co 256 bp. Restryktazy takie mogą strawić DNA na bardzo małe kawałki.
– szóstkowe , rozpoznają sekwencję DNA złożoną z sześciu nukleotydów. Dowolne miejsce restrykcyjne złożone z sześciu nukleotydów występuje statystycznie co około 4096 bp w DNA , w którym ilości poszczególnych nukleotydów są równe. Proporcje te zmieniają się w zależności od organizmu , dlatego dobór enzymu szóstkowego i warunki należy ustalić eksperymentalnie.
– ósemkowe , stosowane niezbyt często. Tną DNA bardzo rzadko.
Zastosowania :
– Konstrukcja map restrykcyjnych. Analizując na żelach produkty trawienia danego DNA różnymi enzymami restrykcyjnymi , stosowanymi pojedynczo , w kombinacjach oraz w ilościach wystarczających lub niewystarczających do pełnego strawienia preparatu , można ustalić wzajemne położenie i odległości pomiędzy sekwencjami rozpoznawanymi przez te enzymy. Mapa restrykcyjna to obraz cząsteczki DNA , na którym zaznaczone są miejsca rozpoznawane przez różne enzymy restrykcyjne z uwzględnieniem odległości między nimi wyrażonej w nukleotydach.
– Klonowanie i obróbka DNA. DNA pocięty enzymami restrykcyjnymi można poddawać ligacji z wektorem. W ten sposób tworzone są zrekombinowane plazmidy czyli plazmidy zawierające sklonowany DNA , który można później poddawać różnym manipulacjom przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych.
– Badanie polimorfizmu miejsc restrykcyjnych (RFLP).
Metody alternatywne fragmentowania DNA – mechaniczna fragmentacja DNA (bardzo rzadko stosowane):
– Shearing przy użyciu strzykawki z igłą. Stopień fragmentacji zależy od grubości igły i ilości przepuszczeń. Uzyskuje się fragment zakończone na tępo ponieważ nici DNA pękają zwykle naprzeciwko siebie. Różnorodność powstałych fragmentów jest bardzo duża gdyż pęknięcie może nastąpić w dowolnym miejscu.
– Sonikacja. Preparat DNA poddaje się działaniu ultradźwięków. Powodują one pękanie nici. Odpowiedni stopień fragmentacji można uzyskać dobierając eksperymentalnie warunki i czas sonikacji.
LIGAZY – trwale łączą pocięte fragmenty.
Ligazy DNA katalizują formowanie wiązań fosfodiestrowych pomiędzy końcem hydroksylowym 3` a końcem fosforowym 5` DNA. Pozwala to na reperowanie jednoniciowych przerw w dupleksie DNA , łączenie fragmentów restrykcyjnych posiadających homologiczne lepkie czy też nawet tępe końce.
Dwa najczęściej stosowane enzymy to ligaza DNA E.coli i ligaza DNA z faga T4. Tylko ta ostatnia jest w stanie wydajnie łączyć tępe końce , nawet w normalnych warunkach reakcji. Wadą jest jej mniejsza specyficzność rozpoznawania struktury końców , co daje większe tło w doświadczeniach spowodowane nieprawidłowymi ligacjami.
