SCREENING BANKU GENÓW CZYLI IDENTYFIKACJA ODPOWIEDNIEGO KLONU. SZUKANIE IGŁY W STOGU SIANA ?
Gdy zależy nam na wyodrębnieniu pojedynczego , konkretnego genu jakiegoś organizmu to po utworzeniu banku genów tego organizmu i stransformowaniu nim odpowiednich komórek gospodarza należy zidentyfkować klon komórek , w którym znajduje się gen. Przeszukiwanie jest zazwyczaj bardzo pracochłonne. Testowanie polega na wysiewaniu na szalki komórek gospodarza np. bakterii z plazmidami badź fagami w takim stężeniu aby możliwe było odróżnienie poszczególnych kolonii lub łysinek. Liczba tych szalek jest w najlepszym przypadku rzędu kilkaset a dochodzi nawet do kilku tysięcy. Wybór metody screeningu jest uzależniony od szeregu czynników
1. METODY HYBRYDYZACYJNE – stosuje się w przypadku dysponowania sondą molekularną DNową lub RNową homologiczną do poszukiwanej sekwencji w różnym stopniu – niekoniecznie w 100%. Nie jest w tym przypadku wymagana ekspresja sklonowanego genu w komórkach gospodarza.
Hybrydyzacja – powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych z cząsteczek o komplementarnych sekwencjach nukleotydów. Pojawiają się one już nawet wtedy gdy istnieją kilkunastonukleotydowe odcinki o komplementarnym układzie zasad. Kompleks taki charakteryzuje się specyficzną „temperaturą przejścia” powyżej której ulega dysocjacji. Specyficzność hybrydyzacji zależy od sekwencji i składu nukleotydów , siły jonowej stosowanych buforów oraz temperatury. Operując tymi parametrami możemy uzyskiwać hybrydyzację cząsteczek , których homologia nie przekracza 50%.
Sondą molekularną może być odcinek DNA lub RNA homologiczny do fragmentu , który chcemy odnaleźć. Niekoniecznie w pełni komplementarny do poszukiwanej sekwencji. Wtedy także zachodzi hybrydyzacja jednak z mniejszą wydajnością a utworzony kompleks jest mniej trwały. Sonda musi być wyznakowana (radioaktywnie lub nieradioaktywnie) czyli związana ze znacznikiem , który umożliwi jej uwidocznienie a zarazem zlokalizowanie zhybrydyzowanej z nią sekwencji.
Sondy :
– Fragment DNA , cDNA lub RNA poszukiwanego przez nas genu sklonowanego wcześniej z innego gatunku dość blisko spokrewnionego. W tym celu wybieramy region ewolucyjnie konserwowany w DNA danego genu czyli taki , w którym w czasie ewolucji nie nagromadziło się zbyt dużo znaczących zmian nawet u różnych , czasami nawet dość odległych ewolucyjnie gatunków. Warunki hybrydyzacji muszą być odpowiednio dobrane. Część poszukiwanego przez nas genu.
– Syntetyczny oligonukleotyd o sekwencji komplementarnej do odcinka DNA kodującego fragment białka jeśli znana jest sekwencja aminokwasowa tego białka. W praktyce oznacza to zsyntetyzowanie całej rodziny takich oligonukleotydów z powodu zdegenerowania kodu genetycznego , z których tylko część będzie idealnie komplementarna do poszukiwanej sekwencji.
– Sonda utworzona dzięki amplifikacji metodą PCR np. bardzo rzadkiego fragmentu DNA.
Sondy znakować można :
– radioaktywnie – do sondy włączany jest nukleotyd znakowany radioaktywnym izotopem. Detekcja opiera się na autoradiografii przy zastosowaniu filmów wrażliwych na promieniowanie.
– nieradioaktwnie np. metodami fluorescencyjnymi – emisja światła o określonej długości fali , wykorzystywane są związki tj. Rodamina , kumaryna czy fluoresceina. Detekcja odbywa się przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego.
– immunochemicznie , cytochemicznie – do sondy włączany jest nukleotyd sprzężony z haptenem (biotyną , digoksygeniną , fluoresceiną). Detekcja odbywa się przy pomocy przeciwciał specyficznych dla danego haptenu. Przeciwciała są sprzężone z umożliwiającymi ich uwidocznienie cząsteczkami : alkaliczną fosfatazą , peroksydazą , barwnikami fluorescencyjnymi czy koloidalnym złotem.
– enzymatycznie – do sondy włączany jest nukleotyd sprzężony z cząsteczką enzymu. Detekcja opiera się na reakcji barwnej katalizowanej przez enzym markerowy.
Metody hybrydyzacyjne to :
– HYBRYDYZACJA TYPU SOUTHERN (DNA-DNA)
– HYBRYDYZACJA TYPU NORTHERN (RNA-DNA)
– HYBRYDYZACJA KOLONIJNA
Hybrydyzacja kolonijna – po transformacji komórek bakteryjnych bankiem plazmidowym. Po wysianiu na szalki Petriego replikuje się kolonie na filtr. Wykonuje się szereg czynności , które mają na celu przytwierdzenie bakterii , ich lizę i denaturację in situ a następnie poddaje się hybrydyzacji i autoradiografii. Dzięki zachowaniu szalki wzorcowej jesteśmy w stanie określić dokładnie kolonię , w której znajduje się hybrydyzujący fragment.
– HYBRYDYZACJA ŁYSINKOWA
Hybrydyzacja łysinkowa – po transformacji komórek bakteryjnych bankiem fagowym i wysianiu ich na szalki Petriego replikuje się kolonie na filtr. Przytwierdza się przeniesione fagi do filtru i hybrydyzuje z sondą i poddaje autoradiografii. Także w tym przypadku dzięki szalce wzorcowej jesteśmy w stanie zidentyfikować łysinki , których pozycje odpowiadają zaczernieniom na kliszy.
2. METODY IMMUNOLOGICZNE – mogą być stosowane do detekcji każdego białka jeśli tylko możemy uzyskać przeciwciała. Należy jednak pamiętać , że przeciwciała wiążą się jedynie z niewielkimi fragmentami białka – epitopami , które mają charakter przestrzenny. Wymagana jest zatem właściwa konformacja białka przy reakcji. Warunkiem użycia tego typu metod jest ekspresja poszukiwanych genów w komórkach gospodarza banku. Szczególnie skuteczne w przypadku bibliotek cDNA. Umożliwia znalezienie genu w przypadku gdy dysponujemy oczyszczonym białkiem a szukamy genu je kodującego.
Metody immunologiczne to :
– TECHNIKA WESTERN (białko-przeciwciało)
3. METODY SELEKCJI BEZPOŚREDNIEJ – stosowane w przypadku gdy znany jest bezpośredni efekt fenotypowy klonowanego genu – gdy jego ekspresja powoduje zmiany morfologiczne lub fizjologiczne transformowanych komórek. Założeniem tego typu screeningu jest ekspresja klonowanych genów w komórkach gospodarza.
Przykłady :
– Poszukujemy genu kodującego b galaktozydazę , po transformacji komórek E.coli bankiem genów i wysianiu ich na podłoże z X-gal – związek , który spowoduje niebieskie zabarwienie kolonii wytwarzających ten enzym. Ponieważ do transformacji używamy komórek nie wytwarzających tego enzymu to jedynie te klony komórek , do których trafił wektor z poszukiwanym genem staną się niebieskie.
– Komplementacja mutacji : poszukujemy gen kodujący jeden z enzymów na szlaku biosytnezy argininy u drożdży , transformujemy szczep drożdży arg_ i wysiewamy na pożywkę bez argininy. W tym przypadku wyrosną tylko te komórki , w których będzie eksprymowany gen kodujący odpowiedni enzym z tego szlaku.
– Poszukujemy genu kodującego hemolizynę , bank genów wysiewamy na podłoże z krwią. Klon zawierający poszukiwany gen ujawni fenotypowy efekt hemolizy erytrocytów wokół kolonii.
