BIBLIOTEKI A MOŻE BANKI DNA I CO SIĘ W NICH PRZECHOWUJE.
BANK (inaczej BIBLIOTEKA) DNA – to zespól fragmentów DNA danego organizmu połączonych z cząsteczkami wektorów. Bibliotekę poddać można screeningowi czyli przeszukaniu przy pomocy różnych metod w zależności od tego czym dysponujemy i czego szukamy.
Dobrze skonstruowany bank genów to taki , w którym każda sekwencja genomowego DNA ma swoją reprezentację w postaci klonu. W przypadku gdy przy konstrukcji banku DNA miało szansę na losowe pęknięcie , tak jak się to dzieje np. przy fragmentacji mechanicznej , do oceny reprezentatywności bibioteki stosuje się wzór :
N=ln(1-P)/ln[1-(I/G)]
gdzie :
N – ilość niezależnych klonów
P – prawdopodobieństwo obecności danej sekwencji w banku (przyjmuje się 99%)
I – wielkość średniego insertu (wstawki) w wektorze wyrażona w parach zasad
G – wielkość genomu w parach zasad
Ponieważ preparat DNA pochodzi z bardzo wielu komórek , każdy rodzaj fragmentu zdarza się w nim wielokrotnie. Wektory łączą się z fragmentami dość przypadkowo. Przy tworzeniu biblioteki trzeba wykorzystać dużą wielokrotność liczby klonów , które powinny być w niej reprezentowane. Mimo wszystko nie otrzymamy nigdy 100% pewności , że każda sekwencja jest w banku obecna. Obliczono , że aby uzyskać 99% prawdopodobieństwo reprezentacji wszystkich klonów w banku potrzeba wyjściowej liczby około 5 000 klonów na wektorach plazmidowych w komórkach E.coli dla drożdży i 800 000 klonów w przypadku człowieka.
Wyróżniamy dwa rodzaje bibliotek DNA :
BIBLIOTEKI GENOMOWE – fragmentacji poddawany jest cały DNA danego organizmu , łączy się go z cząsteczkami wektora. Po transformacji komórek gospodarza banku w każdej z nich znajdzie się jeden wektor. Potomstwo komórki wyjściowej będzie zawierało ten sam fragment czyli zostanie on namnożony inaczej sklonowany. Bibioteka taka jest reprezentacją całego DNA organizmu zarówno kodującego (geny , egzony genów) jak i niekodującego (introny , sekwencje regulatorowe , repetytywne , ruchome i inne o nie znanym znaczeniu). Ma to swoje zalety i wady. Jeśli dobrze przygotujemy taką bibiotekę mamy bardzo duże szanse na znalezienie interesującego nas genu. Często zdarza się tak , że na żadnym z klonów nie znajdziemy całości genu. Dzieje się tak ponieważ jest duża szansa na to , że enzym użyty do konstrukcji banku może mieć miejsce cięcia w obrębie interesującej nas sekwencji. Szansa ta rośnie wprost proporcjonalnie do jej długości. Aby obejść ten problem można tak dobrać warunki trawienia by enzym nie trawił we wszystkich możliwych miejscach co zwiększa szansę na znalezienie całości genu. W przypadku gdy szukanym przez nas odcinkiem DNA jest nie gen ale np. promotor , enhancer czy inna sekwencja regulacyjna bibioteka genomowa jest niezastąpiona.
BIBLIOTEKI cDNA – z komórek izoluje się mRNA a następnie przy użyciu odwrotnej transkryptazy przepisuje się mRNA na DNA tworząc cDNA (complementary DNA – komplementarny do mRNA).
Odwrotna transkryptaza – enzym izolowany z retrowirusów , katalizuje reakcję polimeryzacji dNTP w komplementarny łańcuch DNA używając cząsteczki mRNA jako matrycy. Dodane wolne oligo dT hybrydyzują z 3` końcem łańcucha mRNA (poli-A) i służą jako starter. Następnie mRNA jest usuwane przez podwyższenie pH (pH alkaliczne) , co powoduje hydrolizę RNA ale nie DNA. Jednoniciowy DNA (ssDNA) jest wydłużany na 3` końcu dzięki terminalnej transferazie , która przenosi pojedyncze nukleotydy dG nie wymagając matrycy. Chemicznie zsyntetyzowany starter oligo-dC hybrydyzuje do 3` oligo-dG. Następuje synteza komplemetarnego łańcucha. Powstaje dwuniciowy DNA (dsDNA). Ligowane są krótkie (10-12 bp) kawałki dsDNA , zawierające miejsce rozpoznawane przez konkretny enzym restrykcyjny tzw. linkery. DNA cięte jest tą restryktazą (cDNA jest modyfikowane , przed przyłączeniem linkerów , odpowiednim enzymem , który metyluje specyficzne dla danej restryktazy sekwencje , aby zapobiec cięciu w obrębie cDNA). Wynikiem tych wszystkich zabiegów jest dwuniciowy cDNA z lepkimi końcami z obu stron. Potem postępuje się podobnie jak poprzednio czyli łączy cDNA z cząsteczkami wektora przeciętego tą samą restryktazą i wprowadza do komórek gospodarza banku gdzie ulegną namnożeniu.
Wady : należy pamiętać , że w ten sposób uzyskujemy bibliotekę tylko tych genów , które są w danym momencie i w danej tkance aktywne transkrypcyjnie , dlatego należy dobrze przemyśleć wybór tkanki i czas izolacji. Takiego problemu nie ma gdy poszukiwany gen jest genem podstawowym i we wszystkich tkankach ulega ekspresji. Inną wadą jest reprezentacja w różnych ilościach kopii różnych odcinków cDNA ponieważ nie we wszystkich komórkach transkrypty danego genu będą występowały tak samo licznie.
Zaletą takiego banku jest pewność , że każda cząsteczka cDNA zawiera informację genetyczną odpowiadającą dokładnie jednemu genowi czyli każdy klon to jeden cały gen. Inną korzyścią jest fakt braku intronów co można wykorzystać kiedy chcemy produkować dane białko w komórkach bakterii , która normalnie nie przeprowadza splicingu.
